ELISA-Kit für Human Matrix Metalloproteinase 13/MMP-13 Biomean

Wichtige Informationen aus der Anleitung

Dieses ELISA-Kit dient zur quantitativen Bestimmung der Konzentration von humaner Matrix-Metalloproteinase 13 (MMP-13) in Serum, Plasma, Zellkulturüberständen und anderen Proben. Das Kit ist ausschließlich für Forschungszwecke bestimmt und nicht für die klinische Diagnose geeignet. Lagern Sie das Kit bei 2-8°C. Verwenden Sie keine abgelaufenen Reagenzien und mischen Sie keine Komponenten aus verschiedenen Chargen.

Prinzip des Assays

Der Test basiert auf der Sandwich-ELISA-Methode. Eine mit Anti-MMP-13-Antikörper beschichtete Mikroplatte bindet das MMP-13 aus der Probe. Nach Zugabe eines biotinylierten Antikörpers und HRP-konjugiertem Avidin bildet sich ein Sandwich-Komplex. Die Zugabe von TMB-Substrat führt zu einer Farbreaktion, die durch eine Stopplösung beendet wird. Die optische Dichte (OD) wird bei 450 nm gemessen und ist proportional zur MMP-13-Konzentration.

Kit-Komponenten und Lagerung

Überprüfen Sie vor Gebrauch, ob alle Etiketten und Mengen mit der beiliegenden Tabelle übereinstimmen. Zu den Hauptkomponenten gehören:

• High Standard (Lyophilisiertes Pulver)
• Rekonstitutionslösung
• Standard & Probenverdünnungspuffer
• Microelisa-Streifenplatte
• Bio-Antikörper
• HRP-Konjugat
• TMB-Substrat
• Stopplösung
• Waschlösung (20x konzentriert)

Probenvorbereitung

Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen. Verwenden Sie kein Natriumazid als Konservierungsmittel.

• Serum: Blut gerinnen lassen, zentrifugieren (2000 x g, 20 Min.), Serum abnehmen.
• Plasma: Mit Heparin, Citrat oder EDTA sammeln, zentrifugieren (2000 x g, 20 Min.). Zur Entfernung von Thrombozyten erneut zentrifugieren (10000 x g, 10 Min.).
• Zellkulturüberstand: Zentrifugieren, um Präzipitate zu entfernen.
• Zelllysat: Zellen waschen, mit Lysepuffer lysieren, zentrifugieren und Überstand sammeln.

Reagenzienvorbereitung und Standardverdünnung

Lassen Sie alle Komponenten vor Gebrauch mindestens 120 Minuten auf Raumtemperatur kommen. Die konzentrierte Waschlösung muss im Verhältnis 1:20 mit destilliertem Wasser verdünnt werden. Für die Standardverdünnung wird der Standard rekonstituiert (2000 pg/mL) und anschließend in einer Verdünnungsreihe (1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 0 pg/mL) mit dem Probenverdünnungspuffer in EP-Röhrchen verdünnt.

Assay-Verfahren

1. Standardkonzentrationen und Proben in die entsprechenden Wells geben (50 µL).
2. Biotin-markierten Antikörper zugeben (100 µL, außer Leerwert), 60 Minuten bei 37°C inkubieren.
3. Flüssigkeit verwerfen, 5-mal waschen.
4. HRP-konjugiertes Streptavidin zugeben (100 µL, außer Leerwert), 20 Minuten bei 37°C inkubieren.
5. Waschschritt wiederholen.
6. TMB-Substrat zugeben (100 µL), 15 Minuten bei 37°C inkubieren.
7. Stopplösung zugeben (50 µL).
8. Absorption bei 450 nm messen.

Ergebnisberechnung

Erstellen Sie eine Standardkurve, indem Sie die Standardkonzentrationen auf der x-Achse und die entsprechende Absorption (OD-Wert) auf der y-Achse auftragen. Verwenden Sie eine 4-Parameter-logistische (4-PL) Kurvenanpassung. Multiplizieren Sie das Ergebnis bei verdünnten Proben mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor.

Fehlerbehebung

Bei instabilen Kontrollergebnissen prüfen Sie die Pipettiergenauigkeit, die Äquilibrierungszeit und die Waschschritte. Bei schwacher Farbentwicklung überprüfen Sie die Inkubationszeit, die Temperatur und die Reagenzienqualität.