Bedienungsanleitung für Attogene Universal 12s PCR Barcoding Kit NA2046

Wichtige Informationen aus der Anleitung

Das Attogene Universal 12s PCR Barcoding Kit (Katalognummer NA2046) ist für die quantitative Echtzeit-Analyse der 12s rRNA-Region konzipiert. Wichtiger Hinweis: Dieses Produkt ist ausschließlich für Forschungszwecke bestimmt und nicht für diagnostische Verfahren zugelassen.

Testprinzip

Das Kit verwendet ein genspezifisches Primer-Gemisch zur Amplifikation der 12s rRNA-Region. Die Detektion erfolgt mittels SYBR Green-Farbstoff auf einem qPCR-Instrument. Das Verfahren umfasst die Extraktion genomischer DNA (gDNA), die Vorbereitung eines Reaktionsgemisches und die anschließende Amplifikation durch Taq-Polymerase.

Benötigte Ausrüstung und Reagenzien (nicht enthalten)

• Real-time qPCR-Instrument
• qPCR 2X Master Mix mit 2X SYBR Green
• DNA-Extraktionskit / gDNA-Probe
• PCR-Reaktionsgefäße oder -platten
• Vortex und Zentrifuge
• PCR-saubere 1-ml-Röhrchen
• Mikropipetten und Spitzen

Vorbereitung der Reagenzien

Die Reagenzien sind empfindlich gegenüber Kontaminationen und sollten in einem sauberen Bereich gehandhabt werden. Lagern Sie den Master Mix und die Primer-Mischung bei -20°C. Vermeiden Sie häufige Gefrier-Tau-Zyklen, um die Haltbarkeit zu maximieren. Schütteln Sie alle Reagenzien vor Gebrauch vorsichtig.

Kontrollvorbereitung

• Negative Extraction Control (NEC): Wird bei jeder DNA-Extraktion verwendet, um die Isolierungsmethode zu validieren. Verwenden Sie RNase/DNase-freies Wasser anstelle der Probe.
• No Template Control (NTC): Wird bei der Einrichtung der PCR-Platte verwendet, um Kontaminationen zu prüfen. Ersetzen Sie die gDNA durch RNase/DNase-freies Wasser.

Assay-Einrichtung

Die gDNA-Isolierung muss vor dem Experiment erfolgen. Für optimale Ergebnisse wird eine gDNA-Konzentration von >10 ng/µL mit einem Reinheitsverhältnis von >1,80 empfohlen. Berechnen Sie die Anzahl der benötigten Reaktionen (inklusive NEC, PCT und NTC) und planen Sie eine zusätzliche Menge für Pipettierfehler ein.

qPCR-Protokoll

Bereiten Sie für jede Probe ein Reaktionsgemisch vor. Eine typische Reaktion besteht aus 10 µL 2X Master Mix, 8 µL PCR-Wasser und 1 µL Dual Primer Set. Pipettieren Sie 19 µL dieses Gemisches in jedes Well und fügen Sie 1 µL der gDNA-Probe (oder Kontrolle) hinzu, um ein Gesamtvolumen von 20 µL zu erreichen.

Amplifikationsbedingungen

Verwenden Sie folgende Einstellungen für das qPCR-Instrument:

• Initial Denaturation (Taq-Aktivierung): 94°C für 2 Minuten (1 Zyklus)
• Denaturation: 94°C für 20 Sekunden (35 Zyklen)
• Annealing: 52°C für 30 Sekunden (35 Zyklen)
• Extension: 74°C für 45 Sekunden (35 Zyklen)

Daten sollten während des Extension-Schritts über den SYBR-Kanal (518-530 nm) ausgelesen werden.

Ergebnisauswertung

Überprüfen Sie vor der Interpretation die Integrität der Reaktion. NEC und NTC müssen frei von Amplifikation im SYBR-Kanal sein. Die Ergebnisse werden basierend auf dem Vorhandensein des Targets und der Kontrollen (Positiv/Negativ) bewertet. Bei CT-Werten

Lagerung

Lagern Sie das Kit bei -20°C. Die Haltbarkeit beträgt 12 Monate ab Lagerung unter diesen Bedingungen.