Bedienungsanleitung für das Promega GoTaq® Probe 1-Step RT-qPCR System
Schnellstartanleitung für das GoTaq® Probe 1-Step RT-qPCR System von Promega. Enthält Protokolle zur Reaktionsvorbereitung, thermische Zyklusbedingungen und Richtlinien zur Verwendung von Referenzfarbstoffen.
Inhaltsverzeichnis
Wichtige Informationen aus der Anleitung
Das GoTaq® Probe 1-Step RT-qPCR System ist für quantitative PCR-Assays im Hydrolysesonden-Format optimiert. Es kombiniert GoScript™ Reverse Transkriptase und GoTaq® Probe qPCR Master Mix für eine effiziente Ein-Schritt-Echtzeit-Amplifikation. Das System ist für den Laborgebrauch bestimmt und erfordert eine sorgfältige Handhabung, um Kontaminationen zu vermeiden.
Produktkomponenten und Lagerung
Die Komponenten müssen bei -30°C bis -10°C gelagert und stets vor Licht geschützt werden. Vor der Verwendung sollten die aufgetauten Lösungen vorsichtig gemischt und auf Eis gelagert werden. Bei häufigem Gebrauch kann der Master Mix kurzzeitig bei +2°C bis +10°C für bis zu 3 Monate gelagert werden.
Vorbereitung der Reaktionsmischung
Die Reaktionsmischung wird durch Kombination von GoScript™ RT Mix, GoTaq® Probe qPCR Master Mix, Primern, Sonde und nucleasefreiem Wasser vorbereitet. Die RNA-Vorlage wird im letzten Schritt hinzugefügt. Das System verwendet eine Hot-Start-Chemie, die den Aufbau bei Raumtemperatur ermöglicht.
Optionale Zugabe von CXR-Referenzfarbstoff
Einige Echtzeit-PCR-Instrumente erfordern die Zugabe von CXR-Referenzfarbstoff zur Normalisierung. Je nach Instrumententyp sollte der Farbstoff auf eine niedrige (30nM) oder hohe (500nM) Konzentration eingestellt werden. Die genauen Volumina für die 1ml- oder 12,5ml-Gebinde sind in der Anleitung tabellarisch aufgeführt.
Thermische Zyklusbedingungen
Das System unterstützt sowohl Standard- als auch FAST-Zyklusprogramme. Die Standardbedingungen umfassen eine Reverse Transkription bei 45°C für 15 Minuten, gefolgt von einer Aktivierung bei 95°C für 2 Minuten und 40 Zyklen der Denaturierung (95°C) sowie Annealing/Extension (60°C).
Sicherheit und Kontaminationsprävention
- Verwenden Sie dedizierte Arbeitsbereiche und Pipetten für Vor- und Nach-Amplifikationsschritte.
- Tragen Sie Handschuhe und wechseln Sie diese regelmäßig.
- Verwenden Sie aerosolresistente Pipettenspitzen.
- Öffnen Sie die Reaktionsplatten nach der Amplifikation nicht, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
Praktische Hilfe
Typische Probleme
Öffnen Sie die Reaktionsplatten oder Streifen nach Abschluss der Amplifikation nicht.
Stellen Sie sicher, dass der CXR-Referenzfarbstoff gemäß den Anforderungen Ihres spezifischen PCR-Instruments (niedrige oder hohe Konzentration) korrekt hinzugefügt wurde.
Aliquotieren Sie den Master Mix und den Farbstoff, wenn mehr als 10 Einfrier-/Auftauzyklen zu erwarten sind.
Vor der Verwendung
- Stellen Sie sicher, dass der Arbeitsbereich für PCR-Arbeiten vorbereitet ist.
- Verwenden Sie ausschließlich nucleasefreies Wasser.
- Überprüfen Sie, ob Ihr PCR-Instrument eine Normalisierung mit ROX™-Farbstoff erfordert.
- Bereiten Sie die Primer und Sonden als 20X-Lösungen vor.
- Stellen Sie sicher, dass die RNA-Vorlage frei von genomischer DNA-Kontamination ist.
Technische Daten in der Praxis
- GoTaq® Probe qPCR Master Mix (2X)
- Gebrauchsfertige Formulierung mit Hot-Start-Polymerase, MgCl2 und dNTPs.
- CXR-Referenzfarbstoff
- Dient der Normalisierung bei Echtzeit-PCR-Instrumenten; spektrale Eigenschaften identisch mit ROX™.
- Reaktionsvolumen
- Standardprotokoll basiert auf einem Endvolumen von 20µl.
Modellkompatibilität
- Kompatibel mit Standard- und FAST-Zyklusprogrammen.
- Die dUTP-Formulierung ermöglicht die Verwendung von Uracil-DNA-Glycosylase (UNG) zur Kontrolle von Carryover-Kontaminationen.
Autor der Aufbereitung
Laura Fischer
Fachredakteurin für Gebrauchsanleitungen
Beschreibt zentrale Funktionen, Einsatzbereiche und Hinweise aus Handbüchern in einer kompakten und nutzerfreundlichen Form.